Standpunt van Prof. Valberg over de huidige stand van zaken rond PSSM/MIM en MFM 

Validatie van genetisch onderzoek

Stephanie Valberg DVM PhD DACVIM, DACVSMR, Emeritus Professor, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, Valberg Neuromuscular Diagnostic Laboratory, East Lansing MI, USA 

Carrie Finno DVM PhD DACVIM, Professor, Director Center for Equine Health, University of California-Davis, School of Veterinary Medicine, Davis, CA, USA 

Jessica Petersen PhD, Associate Professor, Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA 

Het doel van ons onderzoek is het identificeren van nieuwe spierziekten bij paarden, het optimaliseren van diagnostische tests en het ontwikkelen van gerichte behandelingen. Wanneer gevalideerde genetische tests beschikbaar zijn, bevelen wij deze aan boven spierbiopsieën. Dr. Valberg heeft het voorrecht gehad deel uit te maken van de teams die genetische tests ontwikkelden voor PSSM1, GBED en MYHM, waardoor spierbiopsieën voor de diagnose van deze aandoeningen niet langer noodzakelijk zijn. Wanneer genetische tests negatief uitvallen, voert Dr. Valberg een diagnostische spierbiopsiedienst uit voor dierenartsen, zodat zij paardenhouders kunnen helpen bij het identificeren van spierziekten bij hun paarden.

Het is bemoedigend om nieuw onderzoek naar spierziekten bij paarden te zien. Een gedegen validatie van nieuw beschikbare genetische tests is echter essentieel, zodat zij dierenartsen effectief kunnen ondersteunen bij het stellen van diagnoses, eigenaren van antwoorden en gemoedsrust kunnen voorzien en – het belangrijkste – de paarden kunnen helpen waarvoor zij bedoeld zijn.

Genetische tests moeten vóór commercialisering correct worden gevalideerd

De bruikbaarheid van genetische tests voor fokprogramma's en veterinaire beoordelingen hangt af van de nauwkeurigheid van die tests. Als je het genoom van het ene paard vergelijkt met dat van een ander, kun je miljoenen genetische varianten ontdekken, waarvan vele naar verwachting de eiwitfunctie beïnvloeden. Het vinden van varianten is niet het moeilijke deel. De uitdaging ligt in het bepalen welke van die varianten daadwerkelijk de ziekte veroorzaken.

Genetische tests bij dieren zijn geen gereguleerde sector, waardoor tests op genetische varianten commercieel kunnen worden aangeboden aan iedereen die er gebruik van wil maken, ongeacht of ze gevalideerd zijn of niet. Paardenhouders en dierenartsen moeten zelf beslissen of ze een bepaalde genetische test willen gebruiken. Het is daarom essentieel dat nauwkeurige informatie beschikbaar is om dergelijke beslissingen te kunnen nemen. Een correcte validatie van genetische tests is belangrijk, omdat onnauwkeurige tests, maar ook een onjuiste interpretatie van testresultaten, kunnen leiden tot verkeerde diagnoses, ineffectieve behandelingen, slechte fokbeslissingen en verlies van genetische diversiteit, onder andere.

De internationale gemeenschap voor paardengenetica heeft normen vastgesteld voor de validatie van genetische tests en beveelt ten zeerste aan deze stappen te volgen voordat een genetische test commercieel beschikbaar wordt gesteld.1 Het naleven van de hieronder beschreven normen voor testontwikkeling is essentieel om het vertrouwen van dierenartsen en eigenaren in testresultaten te behouden, zodat deze zinvolle informatie bieden om hun paarden te helpen.

^{1 American College of Medical Genetics and Genomics Horse Genome Project, https://horse genomeworkshop.com/values}

Ons onderzoek naar commerciële testvarianten voor PSSM2/MFM

Stap 1: Identificeer aangetaste en niet-aangetaste dieren

Identificeer aangetaste en niet-aangetaste (controle)dieren op basis van de gouden standaard voor de diagnose van PSSM en MFM. Het is belangrijk om zo specifiek mogelijk vast te stellen of een ziekte aanwezig is. Als een ziekte een genetische basis heeft, kunt u er bij het opnemen van paarden met de ernstigste vorm van de ziekte in de dataset van uitgaan dat de grote meerderheid van de zieke paarden de genetische variant draagt, terwijl slechts een zeer klein aantal controledieren de variant zal hebben indien deze verantwoordelijk is voor de ziekte.

De varianten P2 en P3 bevinden zich in twee verschillende genen die elk een ziekte kunnen veroorzaken die bij mensen myofibrillaire myopathie (MFM) wordt genoemd. De genetische varianten P2 en P3 bij paarden bevinden zich echter niet op dezelfde positie in die genen als de mutaties die zijn geïdentificeerd bij humane MFM. Het gen waarin P4 zich bevindt, is bij geen enkele soort bekend als oorzaak van ziekte. De initiële verdenking van MFM bij een menselijke patiënt wordt vastgesteld op basis van symptomen van spierzwakte; een definitieve diagnose wordt gesteld via een spierbiopsie, gevolgd door genetisch onderzoek. Bij mensen toont de spierbiopsie een abnormale ophoping van een eiwit genaamd desmine. Als P2, P3 en P4 MFM bij paarden veroorzaken, dan zouden de meest ernstig aangetaste gevallen met hoge niveaus van desmine in spierbiopsies (de gouden standaard voor de diagnose van MFM) de genetische varianten P2, P3 of P4 moeten bezitten.

Wij onderzochten de varianten P2, P3 en P4 bij 37 warmbloeders en 30 Arabische paarden met abnormaal hoge niveaus van desmine, vastgesteld via spierbiopsies. De varianten P2, P3 en P4, afzonderlijk of in combinatie, waren aanwezig bij 60% van de aangetaste warmbloeders en 30% van de aangetaste Arabische paarden. Met andere woorden: de varianten waren niet consistent aanwezig bij de meest ernstig aangetaste paarden. Als deze varianten zouden worden gebruikt om de ziekte te diagnosticeren, zou 40–70% van de gevallen worden gemist.

Stap 2: Test bij niet-aangetaste paarden en de algemene populatie

Test op de genetische variant bij paarden zonder desmine-ophoping en bij paarden uit de algemene populatie. Als P2, P3 en P4 gewoon veelvoorkomende varianten zijn in het genoom van het paard, zullen zij met ongeveer dezelfde frequentie voorkomen bij paarden met abnormaal hoge desmineniveaus als bij:

• paarden met normale desmineniveaus (controles)
• een steekproef van paarden uit de algemene populatie.

Wij stelden vast dat ongeveer de helft van de warmbloeders en Arabische paarden zonder aanwijzingen voor abnormale desmine in hun spierweefsel positief testte voor een P2-, P3- of P4-variant. Daarnaast testte 32% van 209 willekeurig geselecteerde paarden van uiteenlopende rassen positief voor een of meer van deze varianten. Het gebruik van deze tests zou bij minimaal 30–50% van de paarden leiden tot een onterechte diagnose van MFM. Het is niet logisch aan te nemen dat de helft van alle paarden een ziekteveroorzakende genetische variant draagt zonder enig ziektesymptoom te vertonen. Het is veel aannemelijker dat deze P-varianten gewoon veelvoorkomende genetische varianten zijn die niet met ziekte in verband staan.

Percentage of horses with P2, P3, or P4 genetic variants*

Percentage of horses with P2, P3, or P4 genetic variants*

^{*Het percentage aangetaste paarden met de genetische varianten P2, P3 of P4 verschilt niet significant van het percentage niet-aangetaste paarden dat deze varianten eveneens bezit.}

Om de varianten nader te onderzoeken, bestudeerden we spierbiopsieën van 163 Quarter Horses bij wie PSSM2 was vastgesteld op basis van kleuring voor spiersuikers (glycogeen), en van 188 gezonde Quarter Horses (QH) met normale spierbiopsieën. Onze resultaten toonden de varianten in nagenoeg gelijke aantallen bij gezonde en aangetaste paarden: bij 60% van zowel gezonde als aan PSSM2 lijdende Quarter Horses werd één of meer P-varianten aangetroffen (zie onderstaande figuur). Van belang is dat GEEN van de biopsieën van Quarter Horses verhoogde desmineniveaus vertoonde; bijgevolg had geen enkel Quarter Horse MFM, terwijl een P2-, P3- of P4-variant bij deze dieren wel frequent voorkomt.

Beoordeel het effect van de variant op het gen of het resulterende eiwit

Tot op heden zijn er bij het paard geen functionele gegevens aangetoond die de gevolgen van de P2-, P3- of P4-varianten op het gen of het resulterende eiwit aantonen. Het is belangrijk om varianten in kandidaatgenen niet te identificeren en aan te bieden als diagnostische tests voordat is aangetoond dat ze daadwerkelijk de gen- en eiwitfunctie bij het paard veranderen en tot ziekte leiden.

Wij zijn verheugd te zien dat informatie over de frequenties van deze genetische varianten bij Welsh cobs openbaar wordt gemaakt. Wij moedigen het bedrijf aan om de stappen te publiceren die nodig zijn voor de validatie van een genetische test, zoals uiteengezet door de internationale gemeenschap voor paardengenetica en hier beschreven.

Het is belangrijk op te merken dat studiepaarden die door eigenaren zijn aangemeld geen representatieve steekproef vormen (zo kunnen paarden sterker aan elkaar verwant zijn, kunnen er verstorende omgevingsfactoren optreden als alle paarden afkomstig zijn uit vergelijkbare omgevingen, van dezelfde trainers, enz.). Door eigenaren gerapporteerde tekenen van spierziekte zijn bovendien geen veterinaire diagnoses en kunnen overlappen met een breed scala aan aandoeningen (PSSM1, MYHM, HYPP, maagzweren, sacro-iliacale aandoeningen, kissing spine, kreupelheid, zadelpassing, trainingsproblemen, enz.).

Als een brede definitie van de ziekte wordt gehanteerd (zoals kreupelheid en verminderde prestaties), zullen veel paarden positief testen op de P2-, P3- en P4-genetische tests, omdat deze varianten veelvuldig voorkomen. Toeval kan ertoe leiden dat sommige paarden die positief testen voor een variant daadwerkelijk een spierziekte hebben en reageren op behandeling; veel paarden die echter positief testen zullen de ziekte niet daadwerkelijk hebben en zullen pas verbetering vertonen wanneer een correcte diagnose wordt gesteld. Wij zien het als een positief teken dat paarden reageren op een verandering in voedings- en bewegingsregimes; aanpassingen in het management kunnen echter voor een paard gunstig zijn ongeacht zijn genotype.